細(xì)胞介紹

注：本培養(yǎng)基是不直接添加氟尿嘧啶藥物的。

細(xì)胞特性

1） 來源：結(jié)直腸腺癌

2） 形態(tài)：上皮樣   貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后**次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

（1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

（2）完全培養(yǎng)基的配制：

①準(zhǔn)備F12K 培養(yǎng)基：上等胎牛血清，10%；雙抗，1%；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。

②準(zhǔn)備F12K含5-Fu完全培養(yǎng)基：上等胎牛血清，10%；雙抗，1%；5-Fu：400~10^65uM；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積。

（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：

① 細(xì)胞在傳代和剛復(fù)蘇時(shí)較為脆弱，中止液須為不含5-Fu的完全培養(yǎng)基，且在細(xì)胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含5-Fu的完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)再根據(jù)需要濃度添加5-Fu。

②若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢時(shí)，可適當(dāng)降低5-Fu的濃度，或使用不含5-Fu的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-Fu濃度。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

（1）細(xì)胞復(fù)蘇

①將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；

②準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱；

③戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；

④將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm離心5min；

⑤準(zhǔn)備一個(gè)T25培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入4mL完全培養(yǎng)基；

⑥離心完成后棄去上清，用1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

（2）細(xì)胞傳代

①當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代；

②在生物**柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

③向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3mL無菌的1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS；

④向瓶?jī)?nèi)加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸潤(rùn)底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3~5min；

⑤孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入15mL離心管；

注意：如還有部分細(xì)胞未消化下來，可采用分步消化：

a. 準(zhǔn)備一個(gè)無菌的15mL離心管，加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基；

b.將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；

c.向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化2min左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。

⑥1000rpm離心5min；

⑦準(zhǔn)備兩個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶，各加入4mL完全培養(yǎng)基；

⑧離心完成后，棄上清，用2mL完全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個(gè)T25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶各1mL；

⑨水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

（3）細(xì)胞凍存  （注意：細(xì)胞凍存建議每瓶T25凍一支）

①~⑥請(qǐng)參照傳代步驟；

⑦離完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.8mL凍存管中；

⑧將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

⑨**天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。記錄凍存管位置以便下次拿取。